ساخت، کلونینگ و بیان آنتی بادی منوکلونال انسانی شده تراستوزومب بر علیه گیرنده عامل رشد اپیدرمی دو (her2/neu) به روش مهندسی آنتی بادی

تحقیق حاضر با هدف دستیابی به تک کلون های مولد طول کامل زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی منوکلونال داروئی تراستوزومب طی مراحل مختلفی صورت پذیرفت. در ابتدا توالی کدکننده طول کامل هر کدام از زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی با در نظر گرفتن توالی های مناسب برای آغاز و خاتمه رونویسی و ترجمه در ناقل یوکاریوتی طراحی و ساخته شد. سپس هر کدام از توالی ها در داخل ناقلین دوگانه poptivec-topo و pcdna 3.3 topo وارد شد. بعد از انجام مراحل همسانه سازی و انتخاب در میزبان پروکاریوتی، سازه هایی که توالی هر زنجیره را بطور کامل و در جهت درست دریافت کرده بودند، برای تراریختی در میزبان یوکاریوتی (cho dg44) استفاده شدند. تراریختی به روش لیپوفکشن صورت پذیرفت و در نهایت طی مراحل مختلف انتخاب، سلولهایی بدست آمدند که هر دو سازه حاوی ژن زنجیره سبک و سنگین را دریافت نموده بودند. در مرحله بعد انتخاب کلون ها در محیط نیمه جامد با هدف دستیابی به تک کلون های پایدار بیان کننده زنجیره سبک و سنگین آنتی بادی منوکلونال داروئی تراستوزومب صورت پذیرفت. در این مرحله از میان جمعیت تراریخت شده اولیه، هجده سازه بدست آمد که به ترتیب std 3-18, 20, 21 نام گذاری شدند. از طرف دیگر dna ی ژنومی مربوط به هر کدام از کلون ها استخراج شد و با استفاده از pcr چندگانه حضور ژن زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی مورد نظر در داخل ژنوم هر سازه به اثبات رسید. بدنبال این مرحله برای تایید بیان پروتئین اختصاصی از آزمون های sds-page و وسترن بلاتینگ استفاده شد. برای نمونه های سوپ سلولی بعد از تغلیظ، sds-page بر روی ژل 10% انجام پذیرفت و بدنبال آن نمونه ها بر روی غشا pvdf منتقل گردیدند. در اکثر نمونه های بدست آمده از سوپ سلولی، زنجیره سبک با وزن مولکولی kda 28 بصورت یک باند پهن مشاهده شد، در حالیکه باند مربوط به زنجیره سنگین خیلی قابل تمیز نبود. در این مرحله با توجه به اینکه ژن زنجیره سنگین همراه با ناقل poptivec و در کنار ژن dhfr، به داخل ژنوم سلولها وارد شده بود، امکان تکثیر ژنومی با متوترکسات برای ورود نسخه های بیشتری از ژن زنجیره سنگین به داخل ژنوم سلولها وجود داشت. به این ترتیب طی هفت مرحله تیمار سلولها با متوترکسات، سازه هایی بدست آمدند که میزان مساوی از هر دو ژن را بیان کرده و به داخل محیط کشت ترشح می نمودند. در ادامه میزان بیان گیرنده her2 بر روی انواع رده های سلولی بدست آمده از سرطانهای تخمدان و پستان با استفاده از روش های اختصاصی ایمنوسایتوشیمی و فلوسایتومتری و با استفاده از آنتی بادی تجاری هرسپتین و آنتی بادی مشابه تولیدی در این پژوهش مورد مطالعه قرار گرفت. در این میان رده های سلولی sk-br-3 و sk-ov-3 بیشترین توانائی را در اتصال به آنتی بادی های مورد نظر داشتند که نشانگر بیان بالای گیرنده مورد مطالعه بر روی سطح این سلولها می باشد. مقایسه نتایج نشان دهنده قدرت قابل توجه آنتی بادی تولیدی در اتصال به گیرنده هدف در مقایسه با نمونه تجاری هرسپتین می باشد.